ENZIM AMILASE SUMBER BACHILLUS LICHENIFORMIS
Sabtu, 20 Agustus 2016
TUGAS INDIVIDU
ENZIM AMILASE SUMBER BACHILLUS
LICHENIFORMIS
 |
OLEH :
NAMA : HERNAWATI
NIM : 913.04.040
JURUSAN : AGROTEKNOLOGI
SEKOLAH TINGGI ILMU PERTANIAN WUNA
( STIP WUNA )
2016
ENZIM AMILASE
Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel. Amilase mempunyai kemampuan untuk memecah molekul-molekul pati dan glikogen Molekul pati yang merupakan polimer dari alfa-D-glikopiranosa akan dipecah oleh enzim pada ikatan alfa-1,4- dan alfa-l,6-glikosida.
Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling besar, pada bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainya. Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894.
Enzim alfa-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam makanan, minuman dan industri tekstil. Alfa amilase ekstra seluler dihasilkan dari beberapa bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan B. Licheniformis. Amilase adalah enzim yang paling penting dan signifikan dalam bidang bioteknologi, industri enzim amylase merupakan kelas industri yang memiliki kurang lebih 25% pasar enzim dunia. Enzim tersebut dapat diperoleh dari bermacam-macam sumber, seperti tumbuhan, binatang, dan mikroorganisme. Sekarang banyak mikrobia penghasil amylase yang tersedia secara komersial dan mikrobia tersebut hampir seluruhnya menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri produksi pati.
Amilase yang dihasilkan mikroorganisme mempunyai spektrum yang luas pada aplikasi industri karena lebih stabil daripada-amilase yang dihasilkan oleh tumbuhan dan binatang. Keuntungan utama dalam penggunaan mikroorganisme pada produksi amilase adalah kapasitas produksi yang besar dan fakta bahwa mikrobia mudah dimanipulasi untuk menghasilkan enzim dengan karakteristik yang di inginkan.-amilase diperoleh dari bermacam-macam jamur, yeast dan bakteri. Meskipun demikian, enzim dari sumber jamur dan bakteri mendominasi aplikasi dalam sektor industri. amilase mempunyai kemampuan aplikasi yang luas dalam proses industry seperti makanan, fermentasi, tekstil, kertas, deterjen, dan industri farmasi. Amilase dari jamur dan bakteri dapat digunakan dalam industri farmasi dan kimia. Meskipun demikian, dengan perkembangan bioteknologi, aplikasi amilase berkembang di banyak bidang, seperti kesehatan, obat-obatan, dan analisis kimia, seperti aplikasi dalam sakarifikasi pati pada tekstil, makanan, brewing, dan industri distilasi.
Biokimia Enzim Amilase
Amylase Pencernaan makanan secara kimiawi terjadi dengan bantuan zat kimia tertentu. Enzim pencernaan merupakan zat kimia yang berfungsi memecahkan molekul bahan makanan yang kompleks dan besar menjadi molekul yang lebih sederhana dan kecil. Molekul yang sederhana ini memungkinkan darah dan cairan getah bening (limfe) mengangkut ke seluruh sel yang membutuhkan.
Macam-macam Enzim Amilase
Secara umum, amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu alfa-amilase, beta-amilase, dan glukoamilase. Enzim alfa-amilase merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam molekul. Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung nonpe-reduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti. Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim a-amilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4.
Sifat dan Fungsi Enzim Amilase
Enzim amylase yang berfungsi untuk mengubah karbohidrat menjadi gula sederhana. Enzim amylase juga berfungsi untuk mengubah tepung menjadi gula. Secara umum enzim memiliki sifat :
- Bekerja pada substrat tertentu.
- Memerlukan suhu tertentu.
- Keasaman (pH) tertentu pula.
Suatu enzim tidak dapat bekerja pada substrat lain. Molekul enzim juga akan rusak oleh suhu yang terlalu rendah atau terlalu tinggi. Demikian pula enzim yang bekerja pada keadaan asam tidak akan bekerja pada suasana basa dan sebaliknya. pada suhu tinggi aktivitasnya tinggi tetapi kemantapan enzyme rendah. Suhu yang yang membuat aktivitas dan kemantaban suatu enzyme tinggi maka disebut suhu optimum.Jumlah hasil reaksi juga akan mempengaruhi aktivitas enzim.
Telah disebutkan beberapa factor yang mempengaruhi aktivitas enzim salah satunya suhu dan pH. Sehubungan dengan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim, maka semakin meningkat suhu, aktivitas enzim akan semakin meningkat. Pada pemanasan tinggi enzim yang merupakan suatu protein akan mengalami denaturasi protein sehingga aktivitas kerjanya menjadi nol. Pada umumnya reaksi kima dengan naiknya suhu 10 derajat Celcius maka akan meningkatkan kecepatan reaksi sebesar 2 kali. Hal ini akan berlaku pada enzyme dengan suhu maksimum hingga 35 derajat Celcius. Jika lebih dari suhu tersebut enzim akan mengalami denaturasi sehingga merusak fungsi katalisatonya. Umumnya enzim mulai kehilangan sifat katalisatornya pada suhu 35 derajat Celcius dan berakhir pada suhu 60 derajat Celcius.
Oleh sebab itu perlu diketahui nilai suhu dan pH optimum dari enzim amylase yang ada pada air liur. Agar diketahui seberapa besar efek hidrolisis maka diperlukan blanko sebagai pembanding. Blanko ini berisi seperti tabung pengujian yang membedakan hanyalah penambahan air liur. Amilum akan membentuk kompleks dengan Iodium hingga menghasilkan larutan berwarna biru. Warna ini dapat di pakai dalam pengukuran absorbansi yang sebanding dengan kosentrasi amilum. Semakin besar nilai absorbsinya maka semakin besar kosentrasi amilum yang belum terhidrolisis.Untuk mengetahui besarnya hasil hidrolisis maka nilai A uji dikurangi dengan nilai A blanko sehingga di peroleh A yang artinya semakin besar nilai A maka semakin besar pula amilum yang telah terhidrolisis.
Sehingga jika di buatkan sebuah kurva hubungan antara suhu dan pH ,akan diperoleh nilai pH dan suhu optimum yang dipakai oleh enzyme. Enzim amilase adalah salah satu enzim yang mampu dihasilkan oleh jamur dan jamur yang menghasilkan enzim tersebut biasanya disebut jamur amilolitik. Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, jamur yang mampu menghasilkan enzim amilase berasal dari genus Penicillium, Cephalosporium, Mucor, Neurospora, Aspergillus dan Rhizopus.
Substrat dan Kondisi Untuk Sintesis Enzim Amilase
Sejumlah sumber karbon yang diuji dan ditelitinya, maltosa merupakan substrat yang terbaik untuk produksi protein dan amilase. Umumnya tepung gandum dan tepung jagung juga merupakan sumber karbon yang bagus untuk amilase rizhobia.
Produksi amilase, penambahan kalsium (10 mM) atau pepton 1% pada ekstrak yeast pada mediun mineral, akan memperpendek periode lag dan menambah pertumbuhan dan sintesis amilase. Penambahan glukosa pada kultur mengurangi dari sintesis a-amilase, hal ini bisa disebabkan karena glukosa mempengaruhi kegiatan bakteri ini. Suhu optimum pada sintesis amilase adalah sekitar 500 C dan pH optimum untuk sintesis amilase sekitar 7,0. Ekstrak enzim dipertahankan aktivitasnya 100% ketika diinkubasi selama 1 jam pada suhu 900 C dan 40% pada suhu 600 C selama 24 jam.
Komposisi dan konsentrasi media sangat mempengaruhi produksi dari enzim amilase ekstraseluler pada bakteri, yeast, dan Aspergillus sp. Komposisi medium sangat mempengaruhi produksi amilase, seperti halnya sporulasi pada Bacillus cereus. Keberadaan pati akan menginduksi produksi amilase. Keadaan lingkungan dan sumber nitrogen pada media kultur juga akan mempengaruhi pertumbuhan produksi amilase. Disamping karbon dan nitrogen, sodium dan garam potassium, ion metal, dan detergen juga akan mempengaruhi produksi amilase dan pertumbuhan mikroorganisme.
Manfaat Enzim Amylase
Enzim amylase banyak digunakan sebagai industri gula cair, makanan, industri tekstil, dan industri farmasi .Enzim ini juga banyak digunakan pada industri minuman misalnya pembuatan High Fructose Syrup (HFS) maupun pada industri tekstil, sebagai food additive untuk memperbaiki tekstur bahan makanan.Penambahan enzim alfa-amilase dalam bentuk tepung malt atau tepung enzim hasil kerja mikroorganisme dapat meningkatkan kemampuan menghidrolisa pati yang dikandung dalam tepung terigu, dengan demikian khamir yang tumbuh pada pembuatan adonan mendapat energi yang cukup sehingga pembentukan karbon dioksida optimal dan pengembangan adonan menjadi optimal amilase untuk produksi energi alternatif bioetanol, membantu metabolism karbohidrat.
Cara Menghasilkan Enzim Amylase
Degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodine. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati. Enzim amylase dari B. subtilis dapat dipisahkan satu sama lain dan secara subsekuen mengeluarkannya bersama maltose. Enzim amylase dapat dipisahkan dari protease dengan menambahkan insoluble starch ke dalam kultur untuk menyerap amilase.
Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru di dalam iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni bakteri maka tidak ada amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil dapat masuk ke dalam sel untuk digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan pati membuat media berwarna biru gelap. Produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri.
A. Bacillus sp.
Bacillus spmerupakan bakteri berbentuk batang, tergolong bakteri gram positif, motil, menghasilkan spora yang biasanya resisten pada panas, bersifat aerob (beberapa spesies bersifat anaerob fakultatif), katalase positif, danoksidasi bervariasi. Tiap spesies berbeda dalam penggunaan gula, sebagian melakukan fermentasi dan sebagian tidak (Barrow, 1993). Ditambahkan Claus & Barkeley (1986) genus Bacillus mempunyai sifat fisiologis yang menarik karena tiap-tiap jenis mempunyai kemampuan yang berbeda-beda, diantaranya : (1) mampu mengdegradasi senyawa organik seperti protein, pati, selulosa, hidrokarbon dan agar, (2) mampu menghasilkan antibiotik; (3) berperan dalam nitrifikasi dan dentrifikasi; (4) pengikat nitrogen; (7) bersifat khemolitotrof, aerob atau fakutatif anaerob, asidofilik, psikoprifilik, atau thermofilik.
Menurut Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8 th editions dalam
Hadioetomo (1985) kalsifikasi Bacillus spp. adalah sebagai berikut: Kingdom : Procaryotae
Divisi : Bacteria
Kelas : Schizomycetes
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Bacillaceae
Marga : Bacillus
Jenis : Bacillus spp.
Gambar 1. Bacillus spp.
B. Bakteri amilolitik
Bakteri amilolitik merupakan bakteri yang memproduksi enzim amilase ( Frazier
& Westhoff, 1988). Fungsi dari enzim amilase ini yaitu menghidrolisis pati yang dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, tumbuhan dan hewan. Amilase yang dihasilkan oleh bakteri amilolitik ini banyak dimanfaatkan dalam industri kelompok bakteri amilolitik yang cukup dikenal luas antara lain Bacillus, Clostridium, Bacteriodes, Micrococcus, Thermus, dan Actinomycetes (Reddy et al.2003). Naiola (2008) berhasil menemukan 8 isolat mikroba amilolitik pada
Nira dan Laru dari pulau Timor, NusaTenggara Timur yang diidentifikasi sebagai Bacillus licheniformis, Chromobacterium sp, Lactobacillus, Micrococcus roseus, dan Bacillus coagulans. (Haq et al., 2005) menemukan Bacillus licheniformis,
Syu &Chen, (1997) berhasil menenukan Bacillus amyloliquefaciens yang juga mampu mendegradasi amilum.
C. Enzim Amilase
Enzim merupakan katalis seluler, hal itulah yang membuat reaksi biokimia dapat berlanjut berkali-kali lebih cepat. Selain mampu meningkatkan reaksi, enzim memiliki dua sifat lain sebagai katalis sejati. Pertama, enzim tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya. Kedua, walaupun mempercepat reaksi, enzim tidak mengubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Dengan kata lain, enzim dapat membantu mempercepat pembentukan produk, tetapi akhirnya jumlah produk tetap sama dengan produk yang diperoleh tanpa enzim (Madigan et al.,
1997).
Aktivitas enzim di pengaruhi oleh beberapa faktor antara lain :
a. Konsentrasi substrat
Aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi substrat. Kecepatan reaksi akan meningkat apabila konsentrasi substrat meningkat, peningkatan kecepatan reaksi ini akan semakin kecil hingga tercapai pada suatu titik batas yang pada akhirnya penambahan konsentrasi substrat hanya akan sedikit meningkatkan kecepatan (Lehninger, 1998).
b. Pengaruh pH
Aktivitas enzim sangat bergantung pada pH dimana ia berada. Setiap enzim mempunyai pH optimum yang berarti konsentrasi tertentu dimana reaksi enzim berada dalam keadaan maksimal. pH optimal untuk beberapa enzim
pada umumnya terletak diantara netral atau asam lemah yaitu 4,5– 8 (Tranggono dan Sutardi, 1990).
c. Temperatur
Suhu berpengaruh dalam mempercepat reaksi. Reaksi katalis enzim umumnya hanya berlaku sampai 60OC. Enzim akan nonaktif jika berada di atas suhu ini. Minimumnya enzim menjadi lambat dan terhenti pada 70 OC-
80 OC.
d. Konsentrasi enzim
Penambahan konsentrasi enzim akan meningkatkan kecepatan reaksi bila substrat tersedia secara berlebih. Dalam reaksi enzim, kecepatan reaksi sebanding dengan konsentrasi enzim. Semakin tinggi konsentrasi enzim maka kecepatan reaksi akan semakin tinggi (Martin, 1983).
e. Inhibitor
Inhibitor merupakan senyawa atau ion yang dapat menghambat aktivitas enzim (Lehninger, 1998).
Amilase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil ( Reddy et al., 2003). Menurut Chung, et al.,(1997) Enzim amilase merupakan salah satu enzim yang paling banyak diproduksi dan digunakan. Amilase merupakan enzim yang menghidrolisa molekul pati untuk menghasilkan produk bervariasi.
Ditambahkan oleh Whittaker (1994) Amilase merupakan enzim yang bekerja menghidrolisis pati yang dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, tumbuhan dan
hewan. Amilase yang dihasilkan oleh bakteri banyak dimanfaatkan dalam industri, terutama industri makanan, minuman, tekstil, farmasi, dan detergen. Hal ini karena umumnya amilase asal bakteri mempunyai aktivitas yang tinggi dan bersifat lebih stabil dibandingkan yang berasal dari tumbuhan dan hewan. Sebagian besar industri, seperti industri makanan dan minuman menggunakan amilase tahan asam. Pemanfaatan enzim dalam bidang industri harus
memperhatikan faktor penting yang sangat mempengaruhi efisiensi dan efektivitas dari enzim yang digunakan. Amilase merupakan enzim yang paling penting
dalam bidang bioteknologi.
Menurut Poejiadi (1994) amilase dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan enzim yaitu :
1. α-amilase
|
2. Beta amilase (β-amilase)
β-amilase (β-1,4 glukan maltohidrolase) terdapat pada berbagai hasil tanaman, tetapi tidak terdapat pada mamalia, dan mikroba. Secara murni telah dapat diisolasi dari kecambah barley, ubi jalar, dan kacang kedelai. Enzim β-amilase memecah ikatan glukosidaβ-1,4 pada pati dan
glikogen dengan membalik konfigurasi karbon anomeri glukosa dari α menjadi β. Enzim β-amilase aktifpada pH 5,0-6,0 (Winarno, 1986).
|
3. Gamma amilase(γ-amilase)
Glukan 1,4-α-glukosidase, 1,4-α-D-glukan glukohidrolase, exo-1,4-α- glukosidase, glukoamilase, lisosomal α-glukosidase adalah nama lain dari Gamma amilase. Pemutusan ikatan akhir α (1-4) glikosida pada
|
D. Penentuan Karakter Bakter
Koloni bakteri dibentuk oleh sel tunggal suatu jenis bakteri yang terus mengalami pertumbuhan. Setiap koloni bakteri dibedakan dari ukuran, tepi, warna permukaan, elevasi serta variasi lainnya ( Utomo,1983).
Berdasarkan pengecatan Gram, terdapat dua kelompok bakteri yaitu bersifat gram positif dan gran gram negatif. Pengelompokkan ini di dasarkan pada perbedaan peptidoglikan yang terdapat antara bakteri yang bersifat negatif dan positif ( Lay
& Hastowo, 1994). Bakteri juga dapat dibedakan berdasarkan sifat morfologi selnya yang terdiri dari basilia, sprilia, koksi, pembentuk spora dan pleomorfik. Kemampuan fisiologis meliputi kemampuan meghidrolisis amilum, kasein, motilitas, katalase dan lainnya. Selain itu, terdapat perbedaan antara lain sumber energi, cara pemanfaatan nitrogen, cara pemanfaatan karbohidrat, dan pemanfaatan oksigen (Sardjono, 2002). Ditambahkan Lay ( 1994) ciri lain yang dapat membantu dalam karakterisasi mikroba adalah pola pertumbuhan, kemampuan memfermentasi karbohidrat dan penggunaan asam amino.
E. Limbah Cair Nanas
Limbah cair bersumber dari kegiatan industri seperti halnya pembersihan, proses pemisahan, dan prduk konsentrasi nanas. Tingginya rerata kandungan dari bahan organik (BOD, Biological Oxgen Demand) yang terdapat pada limbah nanas yaitu
338 mg/l, menjadikan suatu masalah dalam industri nanas. Setiap harinya, volumelimbah yang dihasilkan berkisar 5.000-7.000 m3. Limbah cair ini banyak mengandung kurang lebih 87 % air, karbohidrat 10,54 %, serat 1,7 %, serat kasar
20,87 % protein 0,7 %, abu 0,5 %, dan lemak 0,02 %, (Atmodjo dalam biota journal, hal 131). Berdasarkan kandungan senyawa organik, limbah nanas ini tinggi akan karbohidrat dan gula, yang sering dimanfaatkan sebagai substrat untuk pertumbuhan bakteri nata synthesizer. Sebelum di buang ke lingkungan sekitar, limbah ini di beri pengolahan khusus, seperti halnya di tampung terlebih dahulu pada kolam IPAL selama 2-3 bulan. Beberapa teknik pengolahan limbah yang telah dikembangkan salah satunya pengolahan secara biologi. Karakteristik biologi digunakan untuk mengukur kualitas airterutama air yang dikonsumsi sebagai airminum dan air bersih.
Bakteri dari Genus Bacillus memainkan peranan utama dalam perkembangan industri. Karena mempunyai sifat yang mudah dipelihara dan dikembangbiakkan juga mempunyai karakter yang beraneka ragam yaitu psikrofilik, mesofilik, termofilik di samping itu alkalofilik, neutrofilik dan asidofilik. Bacillus licheniformis menghasil- kan beberapa enzim ekstraseluler yaitu (J,- amilase, amino peptidase, protease metal, ~-laktamase, endo- N -asetilglukoaminidase dan lipase.'
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri B. licheniformis yang dapat menghasilkan enzim protease yang bersifat alkalin dan termofilik.
Bahan dan Cara Kerja
Bahan
a. Isolat sampel
B. licheniformis ditumbuhkan di dalam media
NutrientAgar (NA)miring. b. Media seleksi enzim
1% susu skim,0,1 % pepton, 2% agar. c. Media kultur bakteri
1% susu skim, 0,1% pepton di dalam bufer
glisin-NaOH pH 8,0 d. Uji aktivitas
0,1% azokasein dalam larutan buffer glycin- NaOH 0,05 M pH 8, 10% asam trikhloroasetat (TCA)
e. Karakterisasi pH
Substrat azokasein dengan variasi konsentrasi bufer glisin-NaOH 0,05M pH 7,5; 8; 8,5; 9,0;
10,0; 11,0.
Cara Kerja
a. Isolat sampel
B. Licheniformis di dalam media NA diinkubasi pada suhu kamar sampai berumur 3 hari.
b. Media seleksi
Media seleksi dituangkan ke dalam cawanpetri steril. Setelah dingin satu ujung ose
B. licheniformis ditumbuhkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 hari.
c. Produksi inokulum.
Satu ujung ose B. licheniformis dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi air steril,
dikocok dengan vorteks. Suspensi bakteri diukur kerapatan optiknya (OD) dengan spektrofotometer padaA 600 nm sampai OD mencapai 0,5.
d. Media produksi enzim
Produksi protease dilakukan dengan menginokulasikan 2,5 mL inokulum ke dalam
25 mL media kultur dandiinkubasi pada suhu
37°C selama 1-6 hari di atas pengocok (shaker) inkubator dengan kecepatan 120 rpm. Setiap hari dilakukan pengambilan sampel sebanyak
3 mL dan dipisahkan filtrat dan endapannya dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan
10.160 x g selama 5 menit. Filtrat digunakan
sebagai larutan enzim dan diuji aktivitas proteasenya. 5
Uji Aktivitas Protease
a. Uji Kadar Asam Amino
Sebanyak 0,2 mL larutan enzim direaksikan dengan 0,2 mL substrat 0,1% azokasein dalam larutan buffer glycin-NaOH 0,05M dengan pH 8 dan diinHkuUbasi pada suhu 40°C selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,6 mL
10% asam trikhloroasetat (TCA). Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 8000rpm selama
5 menit dan filtratdipisahkan dariendapan. Pembacaan Optical density (OD) terhadap tirosin yang dibebaskan dalamfiltrat dilakukan dengan spektrofotometer pada A 280 nm. Carakerja yang sama dilakukan untuk larutan standar tirosin dan blanko berupa air suling. Pada blanko, enzim ditambahkan setelah direaksikan dengan TCA. Satu unit aktivitas enzim protease didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1 ug tirosin dalamkondisi pengukuran tersebut.6
Aktivitas protease diuji dengan mengukur kadar asam amino sebagaiproduk hidrolisis protein dari susu skim oleh enzim protease. Larutan enzim yang menghasilkan asamamino yang terlalutinggi diencerkan terlebih dahulu dan faktorpengenceran digunakan dalamperhitungan aktivitasnya.
b. Karakterisasi suhu,pH dan stabilitasnya
Pengaruh pH dan suhu terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan variasi pH substrat azokasein 7,5-
11 dan variasi suhu 30-70°C. Untuk uji stabilitas
enzim terhadap pH dan suhu, sampel diinkubasi
pada pH dan suhu masing-masing selama 10 menit. Selanjutnya dianalisis seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
Hasil
Pada Gambar 1 dapat dilihat aktivitas kualitatif protease dari B. licheniformis pada media seleksi agar yang mengandung substrat susu skim diperlihatkan dengan adanyazona bening di sekitar koloni bakteri.
Pada Gambar 2 dapat dilihat aktivitas B.
licheniformis dengan waktu inkubasi 1-6 hari.
Aktivitasnya dari 66,79-150,52 U/mL, pada hari ke 2 didapat aktivitas protease tertinggi sebesar
150,52 U/mL. Pada harike 3-6 terjadi penurunan
aktivitas, terutama pada hari ke 4 walaupun pada hari ke 5 terjadi kenaikan lagi.
Pada Gambar 3 dapat dilihat pengaruh suhu terhadap aktivitas protease. Aktivitas variasi dari
51,73- 123,35 U/mL. Pada suhu inkubasi 30°C
sampai dengan 50°C terjadi kenaikkan aktivitas, tetapi pada suhu60°C dan 70°C terjadi penurunan aktivitas. Pada suhu 50°C didapat aktivitas protease tertinggi sebesar 123,34 U/mL dengan
stabilitasnya sebesar 93,14 U/mL.
Gambar 1. Zona Bening di sekitar Koloni B. licheniformis
~ 160 I
<-, 140
2, 120
<l)
|
0.. 60
~ 40
.i::::
~ 20
<r:: 0
Ir- 1 -
r-e-
|
r-
.
2 3 4 5 6
In11kubasi (hari)
Gambar 2. Aktivitas Protease Bakteri B.licheniformis dalam Waktu
Inkubasi 1-6 hari
~
140 100 ~
|
~
"-'
el)
el) 100 eror:
eror: 60
..•e..l..)•
..•e..l..)• 80
;..., 60 40 c,
|
eror: 40 _Aktivitas
.i:::: -+- Stabilitas 20
..6 20 ~
|
30 35 40 50 60 70
Variasi suuhu (ac)
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas protease
|
2,
el)
tr:
-r-.
~
"-'
|
trro:
ro 150
E
..•e..l..)•
50 8
;c...,,
100
40 c,
tr:
tr: -+- Stabilitas
30 ro
.~ 50
.i::::
20 .•....•
.~ 10 ~..•....•
~
~ 0 0
7.5 8 8.5 9 10 11
Variasi pH
tr:
Gambar 4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Protease dan Stabilitas
Pada Gambar 4 dapat dilihat pengaruh pH terhadap aktivitas protease, pada inkubasi 2 hari dan suhu inkubasi 50°C didapat aktivitas berkisar antara 98,3- 193,14U/mL. Sedangkan untuk stabilitas enzim dengan waktu inkubasi 10 menit berkisar 54,31- 83,11 U/mL. Aktivitas tertinggi didapat pada pH 10 sebesar 193,14 U/mL, terjadi penurunan aktivitas setelah enzimnya diinkubasi didalam larutan bufer selama 10 menit sebesar
71,88 %.
Pembahasan
Hasil pengujian secara kualitatif ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni
mikroba. Hasil pengujian secara kualitatifadalah dengan adanya lingkaran bening di sekitar koloni dan pengujian secara semikualitatif adalah hasil bagi diameter lingkaran jernih dengan diameter koloni dan dinyatakan sebagai aktivitas protease secara relatif.7
Isolasi dilakukan dengan menggunakan medium yang mengandung azo kasein, karena azo kasein merupakan substrat yang baik untuk mengisolasi bakteri penghasil enzim protease dan menginduksi sintesis enzim protease alkalin. 8,9
|
48 jam pada suhu 60°C danpH 11.10 Dilihat dari kisaran suhu pertumbuhan, B.licheniformis ini dapat digolongkan sebagai bakteri termofil. Bakteri termofil berkisar antara 45-65°C.11 Aktivitas enzim juga akan meningkat dengan meningkatnya suhu sampai mencapai suhu optimumnya, tetapi setelah melewati suhu optimumnya aktivitas enzim akan menurun." Kondisi fermentasi merupakan faktor penting untuk menghasilkan enzim. Bacillus sp. yang ditumbuhkan pada lingkungan alkali menghasil-kan enzim proteolitik yang alkali lebih tinggi dibandingkan bila bakteri tersebut ditumbuhkan pada lingkungan netral. 13 Protease dari B.licheniformis mempunyai pH optimum untuk aktivitasnya antara8 sampai 9. Stabil pada selang pH yangluas dan dapatdiinaktifkan dengancepat pada pH di bawah 5 dan di atas 11.8 B. licheniformis KA-
08 sangat potensi menghasilkan enzimtermostabil. B. licheniformis merupakan mikroorganisme yang sangat potensial digunakan sebagai sumber enzim, karena bersifat termofilik yang dapat hidup pada suhu tinggi 50-65 °C.14 Untuk B. licheniformis N-2 menghasilkan maksimum proteolitik sebesar
123,29 PU/ml optimumnya pada suhu 60°C dan pH 11.10 Berdasarkan suhu pertumbuhannya mikroba digolongkan menjadi lima kelompok yaitu psikrofil tumbuh pada suhu -5-20°C, mesofil suhu 20-45°C, termofil 45-65°C, termofil ekstrim 65-85°C dan hipertermofil 85-l00°CY Menurunnya aktivitas mengikuti meningkatnya suhu di atas optimum biasanya disebabkan oleh perusakan enzim." Kecepatan reaksi kimia akan meningkat denganmeningkatnya suhu karena akan mempercepat geraktermal molekul dan karenanya akan meningkatkan bagian molekul yang memiliki energi dalam jumlah yang cukup untuk memasuki keadaan transisi. Stabilitas enzim protease ditunjukkan dengan tidak terjadinya penurunan aktivitas setelah enzim diinkubasi selama 10 menit. 16 Padasuhu 70-80°C enzim akan mengalami kerusakan yang mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim. Batasan ini tidak mutlak, karena ada enzim tertentu yang tahan terhadap pemanasan pada suhu tinggi yaitu enzim termostabil dan ada juga enzim yang optimum pada suhu rendah. Enzim-enzim termostabil mempunyai karakteristik biokimiawi yang menarik. Sifattermostabilitas enzim berkaitan
dengan bagian asam-asam amino yang bersifat hidrofobik , intensitas interaksi elektrostatik dan jembatan disulfida di antara asamamino penyusun struktur protein. 12
Aplikasi enzim pada beberapa industri menghendaki enzim-enzim yang dalam beraktivitas tahan terhadap panas (termostabil). Hal ini berkaitan dengan keuntungan yang akan diperoleh bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi dapat menurunkan resiko kontaminasi, meningkatkan kecepatan reaksi sehingga menghemat waktu, tenaga dan biaya, serta menurunkan viskositas larutan fermentasi sehingga memudahkan proses produksi." Dalam industri fermentasi protease alkalin merupakan jenis protease yang paling banyak diaplikasikan dalam bidang industri. 1 Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim. Oleh karena itu, penggalian mikroorganisme penghasil protease perlu dilakukan di Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim protease.
Aktivitas tertinggi enzim protease dari Bacillus licheniformis pada penelitian ini pada pH 10 dan pada suhu 50°C dapat digolongkan sebagai enzim yang mempunyai kemampuan bertahan pada lingkungan alkalin (tahan terhadap basa) dan termofil (tahan terhadap suhu tinggi) sehingga dapat digunakan untuk biodeterjen. Enzim alkalin dan termofil merupakan unsur penting dalam biodeterjen, Protease memiliki pH optimum antara 9 dan 10, apabila ditambahkan ke dalam biodeterjen dapat menghilangkan kotoran dari protein. 18 B. licheniformis adalah bakteri berbentuk batang gram-positif. Banyak digunakan untuk keperluan industri seperti produksi enzim, antibiotik dan metabolit kecil. Suhu pertumbuhan optimalnya adalah 50°C, tetapi dapat juga bertahan pada suhu yang lebih tinggi. Suhu optimal untuk sekresi enzim adalah 37°C. Bakteri ini dapat bertahan hidup di lingkungan yang keras dengan mengubahnya berbentuk spora tetapi apabila kondisi baik, ia akan kembali ke dalam keadaan vegetatif. 19
B. licheniformis adalah mikroorganisme tanah membentuk spora yang memberikan kontribusi untuk siklus nutrisi dan memiliki
|
113,52 .10-2 U/mU sedangkan setelah pemurnian
isolat Bacillus sp. menghasilkan aktivitas spesifiknya 43,02 U/mg (kromatografi penukar ion DEAE Sephadex A 50),21 isolat Aktinomisetes BYL-15 dan BYL-28 yangmenunjukkan aktivitas enzim tertinggi, masing-masing 106,450 U/mL dan 100,00 U/mL filtrat biakan 1, dan dari isolat Bacillus sp. DA 5.2.3 dan L5 masing-masing 2,0
U/mL dan 1,4 U/mL.22
Kesimpulan
Kemampuan produksi enzim protease dari bakteri Bacillus licheniformis memiliki kemampuan, dimana dengan waktu 2 hari inkubasi memiliki aktivitas tertinggi sebesar 150,52 U/mL, pada pH 10 sebesar 193,14 U/mL dan pada suhu
50°C sebesar 123,34 U/mL.
Ucapan Terima Kasih
Terima kasih kami ucapkan kepada DIKTI-
LIPI 2009 yang telah mendanai penelitian ini.
Daftar Pustaka
1. Akhdiya A. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil Buletin Plasma Nutfah, 2003, 9 (2): 38-44.
2. Ahira A Protease adalah pemecah protein. www.anneahira.com/enzim-adalah .•diakses
4 Mei 2011.
3. Moon, S.H. and S.J. Parulekar. Same observation on protease producing in continuous suspention cultures of Bacillus firmus. Biotech. Bioeng, 1993,41 :43-54.
4. Priest, EG. Extracellular Enzymes Sintesis in the Genus Bacillus. Bacteriological Rev.
, 1977,41(3).
5. Cappuccino J.G., and N. Sherman.
Mikrobiology : A Laboratory Manual. Addison- Wesley Publishing Company. California USA, 1983.
6. Yang S.S., C.I. Huang. Proteases production by amylolytic fungi in solid state fermentation. Journal Chinese Agri Chem Soe., 1994,32(6): 589-60l.
7. Naiola, E.,N. Widhyastuti. Isolasi, Seleksi dan Optimasi Produksi Protease dari Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Berita Biologi, 2002, 6(3): 467- 473.
8. Ward, O.P. Proteinase. Di dalam W.M.
Fogarty (ed). Microbial and Enzyme Biotechnology. Applied Science Publisher, New York, 1983.
9. Fujiwara, N. and Yamamoto, K. Di dalam Akhdiya A Isolasi Bakteri PenghasilEnzim Protease Alkalin Termostabil Buletin Plasma Nutfah, 2003, 9 (2): 38-44.
10. Nadeem, M., J.I. Qazi, S. Baig, Q. Syed.
Studies on Commercially Important Alkline
Protease from Bacillus licheniformis N-2
Isolated from Decaying Organic Soil. Turk
Journal Biochemistry, 2007, 32(4): 171-177.
11. Rudiger, A, A Sunna, and G. Antranikian.
Enzymes from Extreme Thermophilic and Hyperthermophilic Archea and Bacteria. Di dalam: Carbohydrases, Handbook of Enzyme Catalysis in Organic Synthesis. VCH Verlagsgesellschafft, Weinhem, 1994.
12. Suhartono, M.T. Di dalam Rahayu, S.
Karakteristik Biokimiawi Enzim Termostabil Penghidrolisis Kitin. Makalah Pengantar Falsafah Sains (PPS 702). Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, 2004.
13. Glazer, AN. and H. Nikaida. Di dalam AgustienAdan Y.Rilda. Produksi Keratinase Termostabil dari Bacillus licheniformis KA-
08 Amobil dan Aplikasinya Untuk Bahan
Penyamak Kulit. Artikel Hibah Bersaing,
2009. repository.un and.ac.id I. ..IARTIKEL- HIBER - ANTHONI - A GUSTIN-2009
diakses 11 Agustus 2011.
14. AgustierrA, danY. Rilda. Produksi Keratinase
Termostabil dari Bacillus licheniformis KA-
08 Amobil dan Aplikasinya Untuk Bahan
Penyamak Kulit. Artikel Hibah Bersaing,
2009. repository.unand.ac.idl...IARTIKEL-
19. Veith,B., Herzberg, c., Steckel, S., Feesche,
HIBER - ANTHONI-
diakses 11 Agustus 2011.
A GUSTIN-2009
J., Maurer, K. H., Ehrenreich, P., Baumer,
S., Henne, A., Liesegang, H., Merkl, R.,
15. VolkWA&MF.Wheeler. Mikrobiologi Dasar.
Jilid 1. Soenartono Adisoemarto Editor. Penerbit Erlangga Jakarta. Terjemahan dari: Basic Microbiology, fifthedition, 1988.
16. Palmer, T. Extraction and purification of enzymes. InUnderstanding Enzymes. Ellis Horwoood Ltd. England, 1991.
17. Rahayu, S. Karakteristik Biokimiawi Enzim Termostabil Penghidrolisis Kitin. Makalah Pengantar Falsafah Sains (PPS 702). Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, 2004.
18. Snoke, John E. (University of California, Los Angeles), and Neal Cornell. Protoplast lysis and inhibition of growth of Bacillus licheniformis by bacitracin. J Bacteriol.
1965, 89:4l5-240.,jombangan.com/tautan/
bacillus-licheniformis. Diakses 10 Mei
2011.
Ehrenreich, A, Gottschalk, G. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol. Microbiol. Biotechnol.
2004,7(4):204-2l1.jombangan.com/tautan/
bacillus-licheniformis diakses 10 Mei 2011.
20. Wikipedia. Bacillus _licheniformis http:// www.epa.gov/pesticides/biopesticides/ ingredients/tech _ docs/brad_ 006492.pdf, diakses 10 Mei 2011.
21. Naiola, E., N. Widhyastuti. Semi Purifikasi dan Karakterisasi Enzim Protease Bacillus sp. Jurnal Berkala Penelitian Hayati, 2007,
13(1): 51-56.
22. Jamilah I, A Meryandini, I. Rusmana, ASuwanto, N.R. Mubarik. Activity of Proteolilytic andAmylolytic Enzymes from Bacillus spp. Isolated from Shrimp Ponds. Microbiology Indonesia, 2009, 3(2): 67-71.
|
Media Litbang Kesehatan Volume21 Nomor 2 Tahun2011 95